Les dosages de PCR en temps réel Applied Biosystems™ TaqMan ® se composent d’amorces spécifiques à la cible et d’une ou plusieurs sondes optimisées pour des types particuliers de mesures. Les mécanismes d’action des différents types de dosage sont décrits ci-dessous.
Les dosages d’expression génétique TaqMan® sont basés sur la chimie de nucléase 5’, laquelle utilise une sonde fluorogénique pour permettre la détection d’un produit de PCR spécifique au fur et à mesure qu’il s’accumule au cours de la PCR.
Chaque dosage contient :
Le schéma ci-dessous illustre le processus de dosage de l’expression génétique TaqMan.
À chaque cycle de PCR, d’autres molécules du colorant sont libérées, entraînant une augmentation de l’intensité de fluorescence proportionnelle à la quantité d’amplicons synthétisée.
Les sondes MGB TaqMan contiennent une moitié de liant au sillon mineur (MGB) qui améliore le différentiel Tm entre les sondes appariées et les sondes mal appariées. En outre, les sondes MGB TaqMan contiennent un extincteur non-fluorescent qui améliore la résolution spectrale lorsque des colorants multiples sont utilisés dans une réaction.
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Les dosages de génotypage TaqMan (Dosages de génotypage SNP TaqMan® et Dosages de génotypage TaqMan® pour le métabolisme des médicaments) sont constitués de paires d’amorces pour PCR pré-optimisées et de deux sondes pour la discrimination allélique.
Chaque dosage contient :
Les dosages de génotypage TaqMan sont utilisés pour amplifier et détecter des allèles spécifiques dans l’ADN génomique (gADN). La figure ci-dessous illustre le processus de dosage de génotypage SNP TaqMan.
Les dosages du nombre de copies TaqMan® sont réalisés en même temps qu’un dosage de référence du nombre de copies TaqMan® dans une réaction en chaîne par polymérase en temps réel (PCR) duplex. Le dosage du nombre de copies permet de détecter le gène cible ou la séquence génomique d’intérêt et le dosage de référence permet de détecter une séquence connue pour être présente en deux copies dans un génome diploïde.
Au cours de la PCR :
a. Un dosage du nombre de copies TaqMan®, un dosage de référence du nombre de copies TaqMan®, un Master Mix pour génotypage TaqMan® et un échantillon d’ADN génomique sont mélangés dans un puits ou un tube.
b. La matrice d’ADN génomique est dénaturée et chaque ensemble d’amorces s’hybride à ses séquences cibles spécifiques. Chaque sonde TaqMan® s’hybride spécifiquement à sa séquence complémentaire entre les sites de liaison de l’amorce sens et antisens. Lorsque chaque sonde d’oligonucléotides est intacte, la proximité du colorant absorbeur avec le colorant rapporteur éteint le signal de fluorescence du colorant rapporteur.
c. Au cours de chaque cycle de PCR, les séquences cibles et les séquences de référence sont simultanément amplifiées par l’ADN polymérase AmpliTaq® Gold. Cette enzyme a une activité des nucléases 5’ qui clive les sondes qui sont hybridées à chaque séquence d’amplicons. Lorsqu’une sonde d’oligonucléotides est clivée par l’activité des nucléases 5’ de l’ADN polymérase AmpliTaq Gold, l’extincteur est séparé du colorant rapporteur, ce qui augmente la fluorescence du rapporteur. L’accumulation de produits de PCR peut être détectée en temps réel en suivant l’augmentation de la fluorescence de chaque colorant rapporteur à chaque cycle de PCR.
Cette méthode d’évaluation quantitative relative est utilisée pour déterminer le nombre relatif de copies de la cible d’intérêt dans un échantillon d’ADN génomique, ce nombre étant divisé par le nombre connu de copies de la séquence de référence.
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